Ce tableau était peut-être destiné à Louis XII roi de France, en l'honneur de son épouse Anne de Bretagne, mais on n'en est pas sûr. Il est possible que Léonard l'ait entrepris pour lui-même. On ignore aussi à quelle date il a été commencé. Certains disent vers 1500, à moins que ce ne soit avant, comme l'affirme Meyer Schapiro. Elaboré à Florence à travers de nombreux dessins et cartons, poursuivi à Milan entre 1508 et 1513, il est resté inachevé et non livré. Léonard l'a emporté en France avec lui quand il a été invité en France par François I, mais le tableau n'est, semble-t-il, entré dans les collections royales que sous Louis XIII. On lui donne parfois le titre d'Anna Metterza, qu'on pourrait traduire en français par Sainte Anne en tierce.

En haut Sainte Anne, puis sa fille la Vierge Marie qui tente, d'un geste à la fois affectueux et inquiet, de retenir son fils Jésus attiré par le sacrifice, représenté par l'agneau. L'art de Vinci tient à sa capacité à représenter l'ambivalence. Jésus veut jouer avec l'agneau, qui est sa mort. La Vierge sait que ce sacrifice est inévitable, mais elle ne peut pas s'empêcher d'essayer de le retenir. Anne, qui représente aussi l'église ou la religion, retient sa fille : la Passion et la Rédemption ne peuvent qu'advenir.

Ce tableau a été commenté, entre autres, par Sigmund Freud et Meyer Schapiro. Freud fait remarquer que les deux femmes offrent le même sourire léonardesque - quoique moins énigmatique et plus bienheureux que la Joconde. Léonard de Vinci était le fils d'une servante, Catarina. Selon Freud (SELV p140), en pratique il a eu deux mères, Catarina et une belle-mère aimante, Donna Albiera, femme de son père. Ces deux mères semblent, dans le tableau, se condenser en une seule figure dédoublée. Le sourire de Sainte-Anne (Catarina) est ambigu : une tendresse sans borne pour l'enfant (le petit Jésus, mais aussi cet enfant génial que fut Léonard), et aussi l'annonce du malheur et des privations que connût Jésus, mais aussi Léonard (du fait de son inhibition, voire de son homosexualité). Quant à Marie, sa robe a une forme étrange, peut-être celle du vautour-milan dont Léonard parle dans un souvenir.

On ne sait pas si Léonard de Vinci était homosexuel, mais il est certain qu'il s'est interdit à jamais la tendresse des lèvres de femme.

Freud rappelle que Léonard de Vinci a été adoré par deux mères aimantes qui, en l'absence d'un père, lui ont apporté de grandes satisfactions. En peignant ensemble Marie et sa mère et en représentant la Vierge à peine plus jeune que Sainte Anne, ce qui est une innovation dans l'histoire de la peinture, il réactualise ce souvenir. Les deux femmes sont mises sur le même plan, et toutes deux ont le sourire de Mona Lisa. Pour Schapiro, du strict point de vue de l'histoire de l'art, cette thèse ne tient pas car le premier carton de préparation de l'oeuvre date de 1498 ou 1499, ce qui est antérieur à la rencontre de Mona Lisa (probablement 1503). De plus, le sourire caractéristique de la Joconde était déjà présent quand Léonard travaillait dans l'atelier de Verrochio, son maître. D'autre part, le thème de Sainte Anne était à la mode au moment où Léonard l'a choisi. Les tableaux associant ces trois personnages, sous le nom de Anna Metterza étaient courants, et représenter les deux femmes dans leur jeunesse se faisait depuis le Moyen-Âge. Sur ces trois plans, Léonard n'a rien apporté de nouveau.

Quelle est alors sa véritable originalité? Entre le carton préparatoire et l'oeuvre, il a substitué un agneau à Saint Jean. L'enfant enfourche et maintient l'agneau, un geste qui a une signification théologique : il exprime sa "Passion". Cette substitution entraîne des conséquences en chaîne. L'action de chaque personnage est commandée par celle d'un autre. Le mouvement d'une partie du corps déclenche l'adaptation de tous les autres. Dans l'entrelacement des corps, chaque mouvement s'oppose à d'autres mouvements du même corps ou d'un corps voisin. La composition est basée sur un équilibre dynamique, qu'on retrouve aussi dans la Cène que Léonard a peinte à Milan de 1495 à 1497. Au groupe fermé légué par la tradition se substitue une articulation qui rend aux individus leur spontanéité et souligne leurs divergences.